Parametri di validazione
Limite di rilevabilità e di quantificazione
Il limite di rilevabilità e quello di quantificazione rappresentano fondamentali caratteristiche di prestazione che il Laboratorio deve valutare durante la validazione del metodo di prova.
Come per altri analiti (es.: PFASs, PCB, POPs, ecc.) anche l’analisi dei residui dei prodotti fitosanitari solitamente è condotta con un metodo di prova in grado di poter misurare, per l’appunto, dei residui, ovvero, il più delle volte, analiti con livelli di concentrazione molto bassi, quindi anche in tracce. E’ pertanto è necessario conoscere le capacità del metodo di prova di misurare livelli di concentrazione molto bassi.
A tale proposito si definiscono:
- LOD o DL: il Limite di rilevabilità;
- LOQ o LoQ: il limite di quantificazione.
LOD o DL
Per la definizione del parametro LOD ricorriamo alla bibliografia scientifica.
Il Sante/11312/2021 [5] definisce il LOD come la concentrazione minima di un residuo di analita, validato, che può essere quantificata e riportata mediante monitoraggio di routine con metodi di controllo validati.
Secondo il VIM [4]: il LOD rappresenta il “valore misurato, ottenuto con una procedura di misura assegnata, in base al quale risulta essere “β” la probabilità di decidere erroneamente che il componente osservato in un materiale è assente, essendo stabilito che deve essere “α” la probabilità di dichiararne erroneamente la presenza“. E nella nota 1: “In assenza di altre indicazioni, la IUPAC raccomanda valori di α e β uguali a 0,05“.
Con altre parole, possiamo dire che il limite di rilevabilità rappresenta la misura di un segnale, corrispondente alla concentrazione di un analita, “significativamente diversa” dal bianco.
E’ importante sottolineare che si parla di concentrazioni prossime a quelle del bianco (analita assente), ma statisticamente differenti.
Si precisa che con l’affermazione: “significativamente diversa” dal campione bianco si intende k volte la deviazione standard del segnale prodotto per l’appunto dal campione bianco. Si precisa altresì che il bianco non rappresenta un unico segnale ma una zona di incertezza nella quale il segnale può variare [8].
… e ancora
Il LOD è pertanto la più bassa concentrazione di analita presente nel campione che può essere rivelata, col metodo di prova in uso nel Laboratorio, ma non necessariamente quantificata, ad un livello noto di confidenza [2].
A valori molto bassi della concentrazione dell’analita la misura, effettuata in condizioni limite, può essere soggetta a variabilità per effetto sia della:
- strumentazione (es.: rumore);
- da errori casuali nell’esecuzione metodologica (es.: errori di pesata, di misura del volume, reagenti contaminati, ecc.)
Si tratta quindi di determinare un criterio per stabilire quando un segnale ossia la misura che ne consegue è significativamente diverso dal bianco.
Calcolo del LOD
Per determinare il LOD possiamo usare vari modi:
A: Metodo IUPAC
Il Limite di rilevabilità dipende dal rapporto fra il valore del segnale analitico e quello delle fluttuazioni statistiche del segnale del bianco. Non è possibile una misura certa del LOD.
Il metodo IUPAC consente di valutare il LOD dal contributo somma del segnale del campione del bianco e k volte lo scarto tipo del bianco. E’ un metodo che considera la varianza del campione del bianco.
Si calcola il LOD con la seguente equazione:
LOD = xB + kSB
dove:
- xB: è la concentrazione media ottenuta dalla ripetizione di almeno 5 [5] campioni “bianchi”. Il numero delle ripetizioni potrebbe essere superiore e comunque riportato in un documento della qualità del Laboratorio;
- SB: è lo scarto tipo emerso della ripetizione dei 5 [5] campioni “bianchi”;
- k: fattore scelto in funzione del livello di confidenza [6]. Dal documento dell’ISS [2], ed in particolare nell’appendice B, viene dimostrato che k=3 dopo arrotondamento.
... ancora
Nell’analisi dei residui dei pesticidi usando, per lo più, usando la cromatografia come tecnica di misura, sono necessari campioni preparati, ad esempio, mediante aggiunte al bianco dell’analita di interesse (spiking), con livelli di concentrazione, prossimi al LOD.
Come possiamo vedere nell’immagine 3, la zona di colore
- grigio: indica assenza dell’analita;
- verde: tra 3SB e 10SB si rileva l’analita ma non si riesce a quantificarlo;
- azzurro: oltre i 10 SB si potrà attuare la quantificazione [8].
La valutazione del LOD con questa modalità è valida, come peraltro riportato nel documento [8], “partendo dall’assunto che la deviazione standard del bianco e del campione siano simili, e ciò può essere ritenuto vero, soprattutto alle basse concentrazioni, nell’intorno del limite di rivelabilità”.
Il riferimento al campione indica la presenza dell’analita oggetto di prova in concentrazioni molto piccole.
B: Metodo della retta di taratura
Dopo aver dimostrato e sempre nella fase di validazione, la linearità, impiegando n punti per la taratura, dalla retta di taratura, si calcola il LOD.
Si esegue la regressione lineare calcolando i valori di yi per ciascun valore di concentrazione xi dalla relazione:
yi = mxi + q
dove:
- m: pendenza della retta;
- q: intercetta della retta.
Dai dati ottenuti mediante la regressione lineare si calcola lo scarto tipo Sy dei residui delle yi, secondo il metodo dei minimi quadrati:
dove:
- yi: risposta sperimentale corrispondente al punto di ascissa xi;
- Y’: valore teorico ottenuto mediante la regressione lineare;
- N-2: i gradi di libertà.
… e ancora
Si sottolinea che Sy rappresenta un indicatore della qualità della retta di regressione. Infatti con un elevato valore dello scarto tipo dei residui, maggiore sarà il contributo all’incertezza fornito dalla retta di taratura (vedi articolo: parametri di validazione).
Si calcola quindi il LOD, la pendenza m e l’intercetta q con le seguenti relazioni matematiche:
dove:
- fd: è un fattore di concentrazione o di diluizione indicato nella procedura di prova;
- m: è la pendenza
- q: è l’intercetta
- Xi e Yi sono i punti sperimentali;
- Y’ e X’ sono i valori medi;
- n: numero di coppie di valori con i quali si è costruita la retta
C: Metodo del rapporto segnale rumore
I metodi di prova per l’analisi dei residui dei pesticidi prevedono, praticamente per la totalità dei controlli, l’uso della tecnica cromatografica per le misure quali – quantitative. Gli strumenti di misura, usati con questa tecnica analitica, sono in grado di discriminare il segnale determinato dall’analita oggetto di prova dal rumore di fondo. Ovviamente questo metodo di valutazione del LOD può essere applicato solo nei casi con presenza di una linea base di rumore [13].
La valutazione del rapporto segnale (S)/rumore (N) è eseguita confrontando i segnali ottenuti dalle misure condotte su campioni, a concentrazioni note e basse dell’analita, con campioni di
bianco. Procedendo in questo modo si stabilisce la concentrazione minima alla quale l’analita può essere rivelato in modo accettabile. Di solito il LOD può essere stimato come la concentrazione dell’analita corrispondente ad un S/N = 3.
D: altre modalità
Il LOD si determina anche in altri criteri:
- delle iperboli fiduciali;
- della propagazione dell’errore [3].
LOQ o LoQ
Con un segnale superiore al LOD, siamo in presenza dell’analita oggetto di prova. Anche in questo caso si stabilisce un criterio per stabilire misure quantitative ossia il limite di quantificazione (LOQ).
Il LOQ viene calcolato sperimentalmente.
Nel documento Sante 11312/2021 il LOQ “rappresenta la concentrazione più bassa dell’analita validato ottenuta con una accuratezza accettabile applicando il metodo analitico completo ed i criteri di identificazione” [5].
Nel documento ISS – EURACHEM [2], il LOQ è il più basso livello di analita che può essere determinato con una prestazione accettabile. Con la: “prestazione accettabile”, linee guida diverse associano la precisione, la precisione e la giustezza o l’incertezza di misura [2].
In altre parole, il LOD lo possiamo definire come la più bassa concentrazione dell’analita rilevato applicando il metodo/procedura di prova, ad un livello di fiducia definito ossia con una probabilità certa di commettere un errore [3]. Tale limite di quantificazione deve essere valutato analizzando i campioni che siano stati sottoposti all’intera procedura di misura [2].
Usando la tecnica analitica cromatografia, è necessario addizionare (fortificare) il bianco con reagenti oppure una matrice contenente una concentrazione molto bassa dell’analita oggetto di validazione, per ottenere uno scarto tipo diverso da zero.
In pratica il LOQ, in analogia con LOD, si determina con varie modalità.
E: metodo IUPAC
Dal contributo somma del segnale del campione bianco e k volte lo scarto tipo del medesimo campione.
LOQ = xB + kSB
dove:
- XB: è la concentrazione media ottenuta dalla ripetizione di almeno 5 [5] campioni “bianchi” o con concentrazioni molto piccole dell’analita oggetto di prova;
- SB: è lo scarto tipo emerso della ripetizione dei 5 [5] campioni “bianchi” o con concentrazioni molto piccole dell’analita oggetto di prova;
- k: fattore scelto in funzione del livello di confidenza desiderato [6]. Il valore IUPAC predefinito è k = 10.
Di solito il LOQ coincide con l’estremo inferiore dell’intervallo di taratura.
F: metodo della retta di taratura
In analogia al LOD, dalla retta di taratura ottenuta con almeno 3 punti si può valutare il LOQ. Prendendo come riferimento il paragrafo B precedente, il LOQ si calcola con la relazione:
dove:
- fd: è un fattore di concentrazione o di diluizione indicato nella procedura di prova;
- Sy: lo scarto tipo dei residui delle yi
E. Altre modalità
Il LOQ si determina anche con le modalità:
- delle iperboli fiduciali;
- della propagazione dell’errore [3].
Individuato il valore del LOQ, come suggerisce il Sante 11312/2021 è fondamentale verificare la precisione a tale livello di concentrazione. Ad esempio, si fortifica un campione bianco con la quantità di analita corrispondente alla concentrazione del LOQ e si valuta lo scarto tipo.
La condizione di accettabilità è:
Ripetibilità RSDr ≤ 20 % (Sante 11312/2021 tab. 4).
Qualora la condizione non fosse soddisfatta, si deve procedere, con nuove prove sperimentali di scarto tipo, con una concentrazione superiore a quelle usata precedentemente.
Si suggerisce di procedere in questo modo per ciascun parametro analizzato con il metodo di prova di interesse per il Laboratorio.
E’ importante sottolineare che il limite di quantificazione rappresenta un livello di concentrazione che si può misurare, e di solito è accompagnata da una incertezza di misura elevata, confrontabile con il valore misurato (es.: 0.01 ± 0.01 mg/kg) [3].
Limite di rilevabilità e di quantificazione – Per saperne di più
- Accredia, https://www.accredia.it/
- Eurachem, https://www.eurachem.org/
- Comitato elettrotecnico italiano, VIM, https://www.ceinorme.it/
- EURL, DG SANTE, https://www.eurl-pesticides.eu/
Limite di rilevabilità e di quantificazione – Norme
- UNI CEI EN ISO/IEC 17025:2018, Requisiti generali per la competenza dei laboratori di prova e taratura
- Sante 11312/2021, Procedure analitiche di controllo della qualità e di convalida del metodo per l’analisi dei residui di pesticidi negli alimenti e nei mangimi, EURL
- Reg. 625/2017, … controlli ufficiali …
- D.Lgs. 31/2001, DM 14/06/2017, D.Lgs. 219/2010 …
Bibliografia
[2] ISS, Rapporto Istisan 16/39, Eurachem, Guida per i laboratori sulla validazione dei metodi e argomenti correlati, 2°ediz. 2014
[3] Arpa – Appa , Linee guida per la validazione dei metodi analitici, Ancona
[4] Vocabolario internazionale di metrologia VIM
[5] EURL, Procedure analitiche di controllo della qualità e di convalida del metodo per l’analisi dei residui di pesticidi negli alimenti e nei mangimi, Sante 11312/2021
[6] CNR, Limit of Detection (LOD). Limit of Quantification (LOQ) e valutazione della calibrazione con Chromeleon Hubaux-Vos. Bologna 24.02.2012
[8] Appunti dalle Lezioni del Prof. Girotti, Università di Bologna
[9] LdR e LdQ dei metodi analitici, Riccardo Narizzano, ArpaL; docente di Chimica Analitica – Università degli Studi di Genova
[13] Università degli Studi di Pisa, Sviluppo e convalida di un metodo HPLC per la determinazione di Proclorperazina base e cleaning validation, Facoltà di Farmacia, A. Signorini, S. Tagliani, 2014-2015
[14] Università degli Studi di Bari, Metodi Analitici Strumentali, Dr. Paolo Bollella
Nota:
Le relazioni matematiche sono state scritte dall’autore usando Microsoft Power Point 365
Autore: Marco Morelli
Pubblicato il 20.08.2022