Parametri di validazione
La selettività è una delle caratteristiche di prestazione che il Laboratorio deve valutare durante la validazione di un metodo di prova.
Dal documento VIM [4], vocabolario internazionale di metrologia, riportiamo la definizione:
"attitudine di un sistema di misura, impiegato nell'ambito di una procedura di misura specificata, a fornire per uno o più misurandi dei corrispondenti valori misurati indipendenti da altri misurandi o da altre grandezze presenti nel fenomeno, corpo o sostanza in esame". E nella nota 1: "Attitudine di un sistema di misura che comprende uno spettrometro di massa a misurare il rapporto delle correnti ioniche generate da due composti specificati senza essere disturbato da altre sorgenti specificate di corrente elettrica".
Con la selettività, parametro adimensionale e senza unità di misura, si esamina l’analita, oggetto di prova, se coinvolto in possibili interferenze durante la sua identificazione e quantificazione.
Per interferenze si fa riferimento a quei contributi dovuti ad impurità, effetti matrice, composti con struttura simile, ecc.
E’ sicuramente una attività non facile da eseguire e non sempre esaustiva.
Possiamo sicuramente affermare che “nessun” metodo di prova è esente da effetti più o meno marcati dovuti alle interferenze [8].
Nel processo analitico solitamente composto da due parti:
- preparazione/estrazione/diluizione del campione da sottoporre a prova;
- misura con lo strumento indicato nel metodo di prova;
la selettività riguarda il punto 2 [7].
Lo studio della selettività consiste nello stabilire che il segnale, prodotto durante la misura:
- sia attribuibile all’analita di interesse, con l’accuratezza desiderata;
- e solo marginalmente agli interferenti o, in generale, ad altri componenti diversi dall’analita [3].
In altre parole, la misura conseguente ad un segnale non sia dovuto alla presenza contemporanea di un qualcosa di simile che provochi una variazione, anche casuale, della proprietà misurata.
Spesso si rende necessario usare le tecniche di conferma dell’identità (es.: nell’analisi cromatografica).
Perchè questo?
Serve per evitare che altri componenti interferiscano nella fase di misura aumentando, conseguentemente, la fiducia nella tecnica analitica usata.
Ovviamente se il metodo di prova è altamente selettivo non servono tecniche di conferma [3].
In pratica
Per lo studio della selettività si dovrebbe fare riferimento soprattutto a:
- impiego di tecniche analitiche strumentali molto selettive quali la massa (gas (GC) o liquida (LC)) o superiori (es.: gas massa GC-MS; GC-MS/MS; GC-MS (QTOF); liquido massa LC-MS; LC-MS/MS; LC-MS (QTOF); ecc.);
- confronto con risultati ottenuti con metodi di prova alternativi (metodi di riferimento), validati, e dotati di tecniche di misura diverse;
- prove di recupero;
- analisi di campioni bianchi.
Non è pratico testare il metodo di prova per ogni potenziale interferente; tuttavia è necessario che quelli comuni siano verificati analizzando un bianco di reagente (processo) per ogni lotto di reagenti [10]. Inoltre quando i reagenti e/o i solventi vengono cambiati tra sequenze di campioni, si consiglia di eseguire ulteriori valutazioni del bianco del reagente [10].
Adatti saggi di identificazione devono essere capaci di discriminare fra composti di struttura simile probabilmente presenti. La conferma si ha con l’ottenimento di risultati positivi da campioni contenenti l’analita, a risultati negativi per campioni privi dell’analita [6].
Un modo per valutare la selettività è quella di studiare l’analita di interesse su campioni di prova reali ai quali, deliberatamente, si addizionano interferenti.
In pratica, con il metodo di prova individuato il Laboratorio valuta la concentrazione dell’analita su campioni reali, prima e dopo l’aggiunta (spike) di interferenti sospetti o ritenuti tali.
Con la modalità descritta il Laboratorio esamina se, in presenza di interferenti, il risultato ne risente in maniera significativa. E’ consigliabile effettuare le prove in prodotti/matrici diverse, ovviamente quelle di interesse analitico, e per livelli di concentrazioni differenti.
Se del caso si possono adottare processi di purificazione, più o meno intensi, atti a ridurre o, nel migliore dei casi, ad eliminare eventuali interferenti [7].
… e ancora
Non è sempre facile conoscere le sostanze che generano interferenze, ed esiste sempre la possibilità di incorrere in qualche sostanza non conosciuta che può interferire con l’analita di interesse. Per questa motivazione è importante eseguire prove su prodotti/matrici differenti per esaminare, nelle condizioni di uso del metodo, l’efficienza nella quantificazione degli analiti oggetto di prova [3].
Ad esempio, in un cromatogramma (vedi immagine 2), malgrado la sua semplicità, i singoli componenti (analiti) devono essere adeguatamente separati e identificati. La selettività si dimostra con la risoluzione di due componenti che eluiscono in tempi di ritenzione molto vicini.
Quantificare un analita in presenza di interferenti può produrre due effetti rilevanti sul risultato finale:
- sovrastima: la concentrazione dell’analita risente della presenza degli interferenti producendo un effetto additivo. Ad esempio in una analisi cromatografica, l’analita oggetto di prova non è separato da uno o più interferenti causando l’effetto somma;
- sottostima: l’analita viene mascherato dalle interferenze con azione di soppressione del segnale sull’analisi quantitativa [3].
Spetta al Laboratorio indicare, solitamente nel metodo di prova, quali accorgimenti adottare per evitare falsi positivi o falsi negativi.
Altri esempi
Esistono moltissimi campi in cui ci s’imbatte nella difficoltà di separare i picchi dei singoli componenti costituenti una miscela, spesso in matrici naturali. Un esempio tipico è quello degli idrocarburi nelle frazioni di distillazione provenienti dal petrolio.
Un altro esempio è costituito dagli isomeri, molecole con lo stesso peso molecolare (PM) ma diversa distribuzione spaziale. Le famiglie dei piretroidi e delle piretrine ne sono un esempio. In queste famiglie gli enantiomeri ed i diastereoisomeri, malgrado le difficoltà, con qualche accorgimento tecnico (es.: colonne chirali, colonne apolari e specifiche programmate, ecc.) possono essere separati.
… e ancora
Una ulteriore modalità per valutare la selettività è quella di indagare sulla capacità del metodo di prova di quantificare l’analita confrontando il risultato con quello ottenuto con altri metodi validati. Quindi applicando alcuni test statistici il Laboratorio esamina i risultati e stabilisce se il metodo di prova è in grado di identificare l’analita in presenza di interferenti. In questo studio il Laboratorio sceglie il livello di confidenza (es.: 95% o 99%), assumendosi un rischio conseguente.
Per le interferenze di tipo proporzionale contenute nella matrice del campione oggetto di prova, il Manuale 179/0 di Unichim (vedi p.to [7] della bibliografia) suggerisce di aggiungere quantità note di analita (spike) al campione e, in corrispondenza di ogni aggiunta, di effettuare la misura strumentale. In questi casi si ottiene un grafico analogo a quello riportato nell’esempio di cui all’immagine 3. Con x si indica la concentrazione e con y la misura strumentale. Con il metodo delle aggiunte, il valore della concentrazione |x|, si identifica partendo dall’equazione:
calcolando il rapporto:
dove:
- q: intercetta della retta sull’asse y;
- m: coefficiente angolare della retta.
Come già è stato anticipato con questa modalità è possibile effettuare la misura in presenza di interferenze di tipo proporzionale. La procedura non consente di rilevare le interferenze di tipo costante, additivo e di inibizione.
E’ sempre necessario procedere con uno studio preliminare per stabilire quali sono le interferenze, come eliminarle o tutt’al più comprendere se il risultato ne risente in maniera significativa [7].
Manuale Unichim
Nel Manuale Unichim 179/4 si precisa di valutare la risposta del bianco e sottrarla qualora risultasse differente da zero.
Il Manuale Unichim 179/0, considerando la pendenza, fornisce indicazioni e modalità di calcolo (vedi Manuale Unichim 179/4) per comprendere se ci si trova in presenza di interferenze di tipo proporzionale che tendono ad innalzare o deprimere il segnale e quindi la risposta strumentale.
Sante 11312/2021 e Rapporto Istisan 16/39
Il documento SANTE 11312/2021, al punto D1, riporta [5]:
"La spettrometria di massa accoppiata a un sistema di separazione cromatografica è una combinazione molto potente per l'identificazione di un analita nell'estratto del campione. Fornisce simultaneamente tempo di ritenzione, rapporti massa/carica e abbondanza relativa (intensità)".
Nel rapporto Istisan 16/39 [2] si legge:
"Se i metodi pubblicati dagli enti di normazione sono utilizzati all’interno del proprio scopo, la selettività in questo ambito è generalmente già stata studiata quale parte del processo di standardizzazione del metodo".
A volte si parla di specificità intendendo la capacità di un metodo di prova di individuare l’analita di interesse. Con selettività si intende la capacità di un metodo di prova di individuare l’analita, presente nel campione. Volendo esprimere il concetto in percentuale potremmo indicare che la specificità rappresenta la selettività al 100%.
A seguito delle verifiche attuate, è importante che il metodo di prova possieda una elevata selettività perchè significa che è meno incline a rilevare dei falsi positivi.
In conclusione si suggerisce di indagare sulla selettività per i metodi [2]:
- sviluppati dal laboratorio al suo interno;
- presi dalla letteratura scientifica ed adattati;
- pubblicati da enti di normazione ed utilizzati al di fuori dello scopo indicato nel metodo normato.
Tuttavia, qualora la tecnica di misura inserito nel metodo di prova possieda caratteristiche intrinseche di selettività (es.: GC-MS; GC-MS/MS o superiori; LC-MS/MS o superiori), ebbene il Laboratorio può ragionevolmente trascurarne la valutazione. Il Laboratorio deve indicare nei documenti del sistema di qualità in quali casistiche non valutare la selettività.
Nei casi in cui il Laboratorio la esamini dovrà indicarla nel documento di validazione. Deve altresì precisare le modalità usate e fornire evidenza oggettiva delle prove fatte.
La documentazione è da conservare secondo i criteri fissati nei documenti del sistema di qualità.
Per saperne di più
- Accredia, https://www.accredia.it/
- Eurachem, https://www.eurachem.org/
- Comitato elettrotecnico italiano, VIM, https://www.ceinorme.it/
- EURL, DG SANTE, https://www.eurl-pesticides.eu/
- Unichim, https://www.unichim.it/
Norme
- UNI CEI EN ISO/IEC 17025:2018, Requisiti generali per la competenza dei laboratori di prova e taratura
- Sante 11312/2021, Procedure analitiche di controllo della qualità e di convalida del metodo per l’analisi dei residui di pesticidi negli alimenti e nei mangimi, EURL
- Reg. 625/2017, … controlli ufficiali …
- D.Lgs. 31/2001, DM 14/06/2017, D.Lgs. 219/2010 …
- Manuale Unichim 179/4, Linea Guida per la convalida di metodi analitici nei laboratori chimici, edizione 2013
Bibliografia
[1] UNI CEI EN ISO/IEC 17025:2018 Requisiti generali per la competenza dei laboratori di prova e taratura
[2] ISS, Rapporto Istisan 16/39, Guida Eurachem, Idoneità per lo scopo dei metodi analitici Guida per i laboratori sulla validazione dei metodi e argomenti correlati, Seconda edizione 2014
[3] Arpa – Appa, Linee guida per la validazione dei metodi analitici, Ancona
[4] Vocabolario internazionale di metrologia VIM, https://www.ceinorme.it/
[5] EURL, Procedure analitiche di controllo della qualità e di convalida del metodo per l’analisi dei residui di pesticidi negli alimenti e nei mangimi, Sante 11312/2021
[6] Università di Pisa, Sviluppo e convalida di un metodo HPLC per la determinazione di Proclorperazina base e cleaning validation, Facoltà di Farmacia, A. Signorini, S. Tagliani, 2014-2015
[7] Manuale UNICHIM 179/0 edizione 2011 “Linee guida per l a convalida dei metodi analitici nei laboratori chimici – criteri generali
[8] Università degli Studi di Bari, Metodi Analitici Strumentali, Dr. Paolo Bollella
[9] EURL – SRM, Workflow to perform quantification by standard addition procedure, Last update 1 July 2017
[10] Codex Alimentarius, Guidelines on performance criteria for methods of analysis for the determination of pesticide residues in food and feed, CXG 90-2017, Adopted in 2017
Autore: Marco Morelli
Pubblicato il 20.08.2022